prosdo.ru 1 2 3 4

ЗАНЯТИЕ№ 1. КОЛОРИМЕТРИЯ, ОБЩИЙ ПРИНЦИП. УСТРОЙСТВО ФОТОЭЛЕКТРОКОЛОРИМЕТРА

Колориметрическим методом определяют концентрацию веществ в окрашенных прозрачных растворах по интенсивности окраски раствора. В основу колориметрического метода анализа положен закон Ламберта-Бугера-Бера: поглощение света прямо пропорционально концентрации вещества в растворе и зависит от толщины слоя (толщины кювет, d). В фотометрии используют монохроматический свет (свет определенной длины волны, ).

Принципиальная схема устройства фотоэлектроколориметра



Расчет концентрации вещества

1) по формуле (с использованием стандартного раствора, с известной концентрацией вещества);

где Со – концентрация опытной пробы;

Ео – экстинкция опытной пробы;

Сст - концентрация стандартной пробы;

Ест - экстинкция пробы со стандартным раствором.

2) по калибровочному графику, который строят, используя стандартные растворы, содержащие различные известные концентрации вещества и сопутствующие им показания оптической плотности.


ЗАНЯТИЕ 2 № 1. ЦВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ И АМИНОКИСЛОТЫ

Цветные реакции на белки и аминокислоты позволяют обнаружить присутствие белка в биологических жидкостях, установить аминокислотный состав. Эти реакции применяют как для качественного, так и для количественного определения белков и аминокислот.

  1. Биуретовая реакция на белки

Принцип метода. Раствор белка в щелочной среде в присутствии сульфата меди (NaOH/CuSO4) окрашивается в сине-фиолетовый цвет. Окраска определена образованием комплексного соединения ионов меди с пептидными группами белка, которых должно быть не менее двух. Таким образом, эта реакция открывает все белки, а также низкомолекулярные пептиды.


2. Нингидриновая реакция

Принцип метода: аминокислоты, пептиды и белки при кипячении с раствором нингидрина дают синее окрашивание (комплекс Руэмана). Реакция характерна для аминогрупп, находящихся в альфа-положении.
СО2




АМИНОКИСЛОТА + НИНГИДРИН  ШИФФОВО ОСНОВАНИЕ

АЛЬДЕГИД




АМИНОДИКЕТОГИДРИНДЕН + НИНГИДРИН КОМПЛЕКС РУЭМАНА (СИНЕ-ФИОЛЕТОВОГО ЦВЕТА)


  1. Ксантопротеиновая реакция Мульдера

(на ароматические аминокислоты)

NO2

t 0100C

HO― ―CH2―CH―COOH + 2HNO3 →HO― ―CH2―CH―COOH

│ │

NH2 NO2 NH2

тирозин динитротирозин

Ароматические аминокислоты (фенилаланин, тирозин, триптофан) при нагревании с азотной кислотой нитруются. Это проявляется развитием желтого окрашивания.


4. Реакция Фоля на цистеин

Реакция характерна для слабосвязанной серы в составе аминокислоты цистеин. Конечный продукт – сульфид свинца – черного цвета.

2О

ЦИСТЕИН + 4NaOH + (СН3СОО)2 Рb СЕРИН + РbS + 4NaOH + 2CH3COOH ацетат свинца сульфид
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО БЕЛКА ПЛАЗМЫ БИУРЕТОВЫМ МЕТОДОМ

БЕЛОК + NaOH/CuSO4 = сине-фиолетовый цвет, интенсивность окраски раствора прямо пропорциональна концентрации белка в сыворотке и определяется фотометрически.

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.

Нормальное содержание общего белка (общий белок крови = альбумины + глобулины + фибриноген) в сыворотке крови у взрослых - 65-85 г/л.

Повышение концентрации общего белка сыворотки крови (гиперпротеинемия) характерно для: ревматоидного артрита, коллагенозов, бронхоэктатической болезни, миеломной болезни, гипериммуноглобулинемии, а также гипогидратации организма (рвота, понос) и венозного стаза;

Снижение концентрации белка в сыворотке крови (гипопротеинемия) отмечается при: голодании, беременности, нефротическом синдроме (гломерулонефрит), хронических заболеваниях печени (гепатиты и циррозы), гастроэнтеропатиях, ожогах, раковой кахексии.

ЗАНЯТИЕ № 3

ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ КОНЦЕНТРИРОВАННЫМИ МИНЕРАЛЬНЫМИ КИСЛОТАМИ

демонстрируют влияние химических факторов на устойчивость белков в растворах.

белок осаждается вследствие химической денатурации белка и образования комплексной соли белка с кислотами.

РАЗДЕЛЕНИЕ АЛЬБУМИНОВ И ГЛОБУЛИНОВ ЯИЧНОГО БЕЛКА МЕТОДОМ ВЫСАЛИВАНИЯ

Высаливанием обратимо осаждают белки, фракционируют их. Используют для выделения белков, в том числе ферментов.


При высаливании происходит дегидратация макромолекул белка и устранение заряда. Осаждение белка обратимо и зависит от молекулярной массы белка и дегидратирующей способности растворов нейтральных солей.

ЗАНЯТИЕ № 4

РАБОТА № 1. КИСЛОТНЫЙ ГИДРОЛИЗ БЕЛКОВ

Гидролиз белка – это расщепление биополимера с присоединением воды по месту разрыва пептидных связей под действием кислот, оснований или протеаз. Последовательность гидролиза белка показана на схеме.

В лабораторных условиях гидролиз белков используется для определения первичной структуры, аминокислотного состава белков. Гидролизаты белков применяются в качестве лечебных препаратов при парентеральном питании. В организме человека и животных постоянно происходит гидролиз белков в пищеварительном тракте и клетках органов под действием протеолитических ферментов.

Большинство биополимеров в реакциях с водой распадаются на мономеры. Гидролиз катализируют протоны, ионы гидроксила и ферменты по механизму нуклеофильного замещения у углерода с карбонильной группой. Полный кислотный гидролиз белков при кипячении происходит в течение 12-96 часов.


ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ТРИПСИНА

Протеолитический фермент трипсин осуществляет расщепление пищевых белков в содержимом двенадцатиперстной кишки в верхних отделах тонкого кишечника. Фермент используется также для расщепления белков в лабораторных условиях.

Протеолитическая активность трипсина регистрируется по количеству освобождающегося аргинина и лизина, которые с фенольным реактивом дают синюю окраску, измеряемую колориметрически.
ЗАНЯТИЕ № 5ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА АКТИВНОСТЬ АМИЛАЗЫ

Позволяет охарактеризовать одно из свойств ферментов – зависимость протекания ферментативных реакций от температуры (термолабильность).

амилаза амилаза


Крахмал --------- декстрины ------------ мальтоза.

Крахмал дает с иодом синий цвет.

Декстрины дают с иодом фиолетовое, красно-бурое окрашивание.

Мальтоза – желтый (цвет иода в воде).

ВЛИЯНИЕ АКТИВАТОРОВ И ИНГИБИТОРОВ НА АКТИВНОСТЬ АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ

Активаторы и ингибиторы регулируют действие ферментов. Эти сведения используют для изучения влияния ксенобиотиков и изучения воздействия на энзимы изменяющихся концентраций нормальных метаболитов клетки.

При активации идет конформационная перестройка активного центра фермента и увеличивается скорость реакции. Ингибиторы оказывают противоположное действие (механизмы различны: через аллостерический центр, путем ковалентного связывания, денатурации и т.д.).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АМИЛАЗЫ (ДИАСТАЗЫ) В СЫВОРОТКЕ КРОВИ И МОЧЕ

ПО МЕТОДУ КАРАВЕЯ

Определение активности амилазы в моче и сыворотке крови используют для диагностики заболеваний поджелудочной железы.

Метод основан на колориметрическом определении концентрации крахмального субстрата до и после его ферментативного гидролиза. В качестве рабочего раствора используется 0,01 н. раствор йода.

РАСЧЕТЫ. Расчет активности α-амилазы в г расщепленного крахмала на 1 л сыворотки за 1 час инкубации при 370 С производят по формуле:

Ек – Еоп

Х = -------------------- х 240

Ек

Ек - экстинкция контрольной пробы; Еоп – экстинкция опытной пробы.

НОРМА: Нормальные показатели активности фермента; для сыворотки крови – 16-30 г/час л, мочи – 28-160 г/час л.

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.

Активность α-амилазы в сыворотке крови в норме = 16 – 30 г/час•л, в моче – 28 – 160 г/час•л.

Повышение активности фермента наблюдается при паротите, панкреатите, раке поджелудочной железы, перитоните, циррозе печени, остром инфекционном гепатите, внематочной беременности, диабетическом кетоацидозе.

Снижение активности α-амилазы отмечается при атрофии поджелудочной железы, нарушении фильтрационной функции почек, кахексии.

ЗАНЯТИЕ № 6


следующая страница >>