prosdo.ru
добавить свой файл
1 2 ... 4 5
Практическое занятие № 6. Созревание РНК: процессинг и сплайсинг.

Процессинг разных видов РНК эукариот
Различные молекулы РНК, которые, как известно, отличаются своей вторичной и, тем более, третичной структурой выполняют в клетке множество разнообразных функций. Например, матричные или информационные РНК (иРНК) направляют биосинтез белка, транспортные РНК (тРНК) переносят соответствующие аминокислоты на растущую полипептидную цепь, а рибосомные РНК (рРНК) формируют в составе рибосом каталитический центр для белкового синтеза. Вдобавок специфические молекулы РНК (некоторые UРНК и РНК I и II групп) удаляют интроны из незрелых первичных транскриптов иРНК, формируют 5/-концы транспортных РНК (РНК-компонент в составе РНКазы Р), обеспечивают модификацию и расщепление рРНК (большинство UРНК, малых ядерных РНК), а также расщепление других молекул РНК (например, hammerhead РНК). Молекулы РНК могут даже обеспечивать изменения первичной структуры иРНК (например, направляющая РНК у Trypanosoma) и регулировать развитие метаболических путей (как, например, при формировании пола у Drosophila).

Гены, которые кодируют различные виды молекул РНК у эукариот, транскрибируются в ядрах клеток этих организмов с участием РНК-полимераз I, II или III, однако первичные транскрипты фактически никогда не бывают зрелыми, функционально активными молекулами. Вместо этого, эти крупные предшественники РНК (пре-РНК) подвергаются процессингу в ходе различных реакций включающих разрезание, соединение и химическую модификацию, что в конечном итоге приводит к формированию их конечной физиологически активной структуры. Фактически обнаружение существенных различий в размерах предшественников и зрелых РНК явилось первым доказательством существования процессинга РНК у эукариот. При этом было установлено, что реакции посттранскрипционного процессинга одних видов РНК часто направляются или даже катализируются другими видами РНК.

События, лежащие в основе процесса созревания важнейших видов молекул РНК сильно варьируют в соответствии с природой самих РНК. В частности процессинг молекул пре-иРНК включает 5/-кэпирование, 3/-полиаденилирование и «внутренний» сплайсинг. Образование зрелых 18S, 5.8S и 28S рРНК рибосом происходит путем их вырезания из общего предшественника с последующим псевдоуридилированием и метилированием индивидуальных молекул рРНК. Транспортные тРНК, которые также происходят из крупных предшественников, подвергаются разрезанию по обоим концам, происходит добавление нуклеотидов по 3/-концу, протекают многочисленные реакции модификаций азотистых оснований и, часто имеет место сплайсинг. С другой стороны, эукариотические 5S рРНК не нуждаются в процессинге, в крайнем случае, происходит «подравнивание» их 3/-концов. В противоположность иРНК эукариот у прокариот первичные транскрипты иРНК непосредственно используются в процессе трансляции, в то время как молекулы 5S рРНК прокариот вырезаются из длинных предшественников пре-рРНК. Как у эукариот, так и у прокариот стационарные концентрации зрелых молекул всех видов РНК определяются комбинацией скоростей их синтеза, процессинга и круговорота.

Процессинг транскриптов, синтезируемых РНК-полимеразой II
РНК-полимераза II (pol II) ответственна за образование всех иРНК, некоторых малых ядерных РНК (snRNA, мяРНК) и многочисленных малых ядрышковых РНК (snоRNA). Бóльшая часть транскриптов РНК-полимеразы II подвергается похожим изменениям в ходе процессинга пре-иРНК. Однако иРНК большинства гистонов, а также молекулы мяРНК (snRNA) и snоРНК подвергаются различным изменениям в реакциях созревания. Хотя гены и их первичные транскрипты сильно отличаются в размерах – средняя длина зрелых молекул иРНК млекопитающих составляет примерно 2 kb. В противоположность их ядерные предшественники, называемые гетерогенными ядерными РНК (гяРНК, гяРНК), в 2-20 раз длиннее зрелых иРНК. В конечном счете, только около 10% типичных гяРНК поступает в цитоплазму: остальные распадаются в ядре. В ядре гяРНК превращаются в иРНК в результате реакций включающих модификации их 5/- и 3/-концов и удаления сегментов из середины молекул. Эти различные события протекают с высокой точностью на образовавшейся гяРНК как только она отделяется от РНК-полимеразы.
5/-Кэпирование
Поскольку все виды молекул РНК синтезируются в направлении 5/ → 3/, исследователи были поражены фактом отсутствия характерных 5/-концов у эукариотических иРНК. Вместо этого исходная 5/-трифосфатная часть первичного транскрипта соединяется с остатком GTP необычной 5/-5/-трифосфатной связью, при этом 3/-ОН группа остатка гуанозина, расположенного на 5/-конце иРНК, остается свободной. После этого «перевернутый» гуаниновый нуклеотид метилируется по положению N7 азотистого основания, а затем первый и иногда второй нуклеотиды исходной иРНК метилируются по 2/-О-положению рибозы. Образовавшаяся в результате структура получила название 5/-кэпа (5/-сар).

5/-кэп формируется на ранних стадиях транскрипции еще тогда, когда синтезирующийся первичный транскрипт состоит всего из 20-30 нуклеотидов, а ферменты, которые обеспечивают кэпирование являются составной частью комплекса РНК-полимеразы II. Кэп в иРНК действует как место «посадки» (место узнавания для специфических ферментов) специфических ферментов и выполняет несколько функций:


  • кэп помогает определить 5/ границу первого интрона (см. далее) для того, чтобы обеспечить правильный сплайсинг;

  • кэп принимает участие в транспорте иРНК из ядра в цитоплазму;

  • кэп принимает участие в инициации трансляции благодаря связыванию с фактором инициации трансляции eIF-4Е и обеспечивает начало белкового синтеза с инициирующего кодона AUG в иРНК;

  • кэп стабилизирует иРНК и делает ее устойчивой к деградации под действием 5/-экзонуклеаз.


3/-Полиаденилирование
На противоположном конце зрелой иРНК начиная от 5/-конца располагается участок, состоящий из 50 – 200 остатков адениловой кислоты. Эта область обозначаемая поли А (poly A) не кодируется геномом, а добавляется в ходе процессинга в ядре клеток. РНК-полимераза II формирует первичный транскрипт, который часто на многие тысячи нуклеотидов превосходит размеры окончательной зрелой иРНК. Как только 3/-последовательность иРНК транскрибировалась, специфический участок РНК, выполняющий роль сигнала для полиаденилирования, (он включает последовательность AAUAAA у многоклеточных и, иногда, более вырождающуюся A/U-богатую область у дрожжей), направляет огромный мультиферментный комплекс для расщепления пре-иРНК на расстоянии примерно в 25 нуклеотидов далее последовательности AAUAAA (рис. ). Цепочка остатков А (