prosdo.ru 1


Київський національний університет імені Тараса Шевченка

ННЦ ,,Інститут біології”

Кафедра біохімії

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА


,,ПРОВЕДЕННЯ ЕЛЕКТРОФОРЕТИЧНОГО РОЗДІЛЕННЯ ДНК В АГАРОЗНОМУ ГЕЛІ”

З КУРСУ “БІОТЕХНОЛОГІЯ”

для студентів денної форми навчання

Затверджено на засіданні

кафедри біохімії,

протокол №___

від “__” _________2012р.

Упорядники:
к.б.н., асист. Мандрик С.Я.

Київ – 2012
Умовні позначення:

Трис



трис-(оксиметил)-амінометан ((HOCH2)3CNH2);

(50×), (30×), (10×) тощо



позначення кратності концентрованих розчинів - відповідно, 50-, 30-ти та 10-ти кратні концентровані розчини

ЕDТА



етилендиамінтетраацетат;

мРНК



матрична рибонуклеїнова кислота;

УФ-випромінювання



ултрафіолетове випромінювання











Техніка безпеки

Усі маніпуляції, які включають:

- приготування розчину етидію бромистого;

- внесення розчину етидію бромистого в розчин агарози;


- заливку агарози у форму для геля;

- переміщення агарози у прилад для горизонтального електрофорезу;

- контроль розділення нуклеїнових кислот та фотографування геля за допомогою трансілюмінатора;

- утилізацію використаного агарозного геля

ПРОВОДЯТЬ В СПЕЦІАЛЬНИХ ОДНОРАЗОВИХ РУКАВИЦЯХ, А ЗА НЕОБХІДНОСТІ - ПІД ВИТЯЖНОЮ ШАФОЮ!!! Етидій бромистий -є СИЛЬНИМ МУТАГЕНОМ, тому слід попередити потрапляння цієї речовини на шкіру, або слизові оболонки. У випадку потрапляння етидію бромистого на шкіру або слизові оболонки необхідно промити водою і звернутись до викладача за подальшими вказівками.

Фотографування гелів і візуальний контроль розділення нуклеїнових кислот за допомогою трансілюмінатора ЗДІЙСНЮЮТЬ В СПЕЦІАЛЬНИХ ОКУЛЯРАХ АБО ЗА ДОПОМОГОЮ ЗАХИСНОГО ЕКРАНУ!!! Ультрафіолетове випромінювання трансілюмінатора згубно впливає на слизові оболонки, зокрема слизові оболонки ока!
ЗАГАЛЬНІ ВІДОМОСТІ ПРО ЕЛЕКТРОФОРЕТИЧНЕ РОЗДІЛЕННЯ НУКЛЕЇНОВИХ КИСЛОТ В АГАРОЗНИХ ГЕЛЯХ

Електрофоретичне розділення в агарозному гелі - стандартний метод, який використовується для розділення, ідентифікації та очистки ДНК та РНК. Під час електрофоретичного розділення в гелі можна безпосередньо моніторити положення зразків ДНК чи РНК - оскільки полоси нуклеїнових кислот в гелі можна візуалізувати за допомогою флюоресціюючого та інтеркалюючого барвника етидію бромистого. За допомогою бромистого етидію в ультрафіолетових променях візуально можна виявити близько 0,1 мкг нуклеїнових кислот.

При електрофоретичному розділенні швидкість міграції нуклеїнових кислот в агарозному гелі залежить від 5 головних параметрів: розмірів молекул нуклеїнових кислот; концентрації агарози; конформації нуклеїнових кислот; показника напруги електричного поля; вмісту азотистих основ і температури.

Розмір молекул нуклеїнових кислот. Швидкість руху лінійних молекул нуклеїнових кислот в агарозному гелі обернено пропорційна десятковому логарифму їх молекулярних мас.


Концентрація агарози. Між логарифмом електрофоретичної рухомості ДНК (μ) і концентрацією агарози геля (τ) існує пряма залежність, яка описується рівнянням

,

де μ0 - вільна електрофоретична рухомість, а константа Кr називається коефіцієнтом сповільнення і залежить від властивостей геля і від розмірів та форми молекул нуклеїнових кислот. Нижче наведено концентрації агарози в гелі, які використовуються для розділення молекул ДНК різного розміру (таблиця 1).
Таблиця 1. Приготування агарозних гелів різної концентрації для розділення відповідних фрагментів ДНК

Концентрація агарози в гелі (%)

Область розмірів лінійних молекул ДНК (kb), які ефективно розділяються

0,3

60-5

0,6

20-1

0,7

10-0,8

0,9

7-0,5

1,2

6-0,4

1,5

4-0,2

2,0

3-0,1

3,0-4,5

менше 0,1 kb

Конформація нуклеїнових кислот. Молекули ДНК з однаковою молекулярною масою але різними конформаціями рухаються в агарозному гелі з різними швидкостями. Наведемо приклад: необхідно розділити три форми ДНК з однаковою молекулярною масою - кільцеву (форма І), кільцеву з одноланцюговим розривом (форма ІІ) і лінійну (форма ІІІ). Перш за все, показники відносної рухомості трьох форм ДНК залежать від концентрації агарози в гелі, а також, від таких факторів, як сила струму, іонна сила буферного розчину та кількість суперспіральних витків у молекулах ДНК (зокрема, для форми І). За одних умов форма І рухається швидше, за інших - повільніше в порівнянні з формою ІІІ. Щоб однозначно визначити конформацію ДНК необхідно провести електрофоретичне розділення у присутності зростаючих концентрацій барвника етидію бромистого. Зі збільшенням концентрації барвника зростає кількість молекул етидію бромистого, які зв’язуються з ДНК. При цьому кількість негативних супервитків спіралі ДНК у формі І поступово знижується, а швидкість руху молекул форми І в гелі також знижується. За критичної концентрації молекул барвника (коли в ДНК більше не залишається суперспіральних витків), швидкість руху форми І сягає мінімальних значень. Наступне внесення нових порцій етидію бромистого призводить до утворення позитивних супервитків - в результаті рухомість форми І починає зростати. Показники рухомості форм ІІ та ІІІ при збільшенні концентрації барвника знижуються (по-різному) - це також відбувається внаслідок нейтралізації зарядів і збільшення жорсткості молекул ДНК під впливом бромистого етидію. Додатково, слід зазначити, що для більшості препаратів ДНК форми І, критична концентрація бромистого етидію (поява позитивних супервитків і збільшення рухомості) знаходиться в області концентрацій 0,1-0,5 мкг/мл.


Показник напруги електричного поля. За низьких значень напруги швидкість переміщення в гелі лінійних фрагментів ДНК прямопропорційна напрузі. Однак, зі збільшенням напруги електричного поля рухливість фрагментів ДНК з високою молекулярною масою зростає експоненційно. Відповідно, зі збільшенням напруги ефективне розділення фрагментів ДНК в агарозному гелі знижується. Максимальна ефективність розділення фрагментів ДНК спостерігається при напрузі, яка не перевищує 5 В/см довжини гелю.

Вміст азотистих основ і температура. Електрофоретична рухомість ДНК в агарозних гелях (на відміну від поліакриламідних гелів) слабко залежить від складу азотистих основ і від температури геля. В агарозних гелях в області температур від +4 до +30 ºС не відбувається зміни рухомості фрагментів ДНК різного розміру. Зазвичай, електрофоретичне розділення фрагментів ДНК проводять при кімнатній температурі. Однак, слід зазначити, що гелі, які містять менше 0,5% агарози дуже м’які - тому з такими гелями краще працювати при температурі +4 ºС.
ПРИЛАДИ ДЛЯ ПРОВЕДЕННЯ ГОРИЗОНТАЛЬНОГО ЕЛЕКТРОФОРЕЗУ

За більш ніж 40 років з моменту запровадження методу електрофоретичного розділення в агарозному гелі, було запропоновано різні варіанти конструкцій приладів для горизонтального електрофорезу. Зараз більшість кювет для проведення горизонтального електрофорезу є модифікацією приладу запропонованого Шефнером, в якому агарозний гель розміщується на окремій скляній чи пластиковій пластинці або в спеціальній ванночці. Пластинку встановлюють на платформі приладу таким чином, що гель знаходиться безпосередньо під поверхнею буферного розчину для проведення електрофорезу. Опір геля мало відрізняється від показника опору буферного розчину для електрофорезу - тому через гель проходить значна частина струму.
БУФЕРНІ РОЗЧИНИ ДЛЯ ПРОВЕДЕННЯ ГОРИЗОНТАЛЬНОГО ЕЛЕКТРОФОРЕЗУ

Для проведення горизонтального електрофорезу зазвичай використовують такі буферні системи: трис-ацетатну, трис-боратну і трис-фосфатну (концентрація близько 50 мМ і рН 7,5-7,8) (таблиця 2). Буферні розчини готують у вигляді вихідних концентрованих розчинів певної кратності і зберігають при кімнатній температурі.


Буферна ємність трис-ацетатного буферного розчину порівняно низька і за тривалого багаторазового використання ця буферна система виснажується. Тому, при роботі з ТАЕ, рекомендують частіше проводити заміни буферного розчину. Трис-боратна та трис-фосфатна буферні системи забезпечують добре розділення фрагментів ДНК і володіють значно вищою буферною ємністю в порівнянні з ТАЕ. Слід зазначити, що агарозний гель готують за допомогою того буферного розчину, в середовищі якого буде проходити електрофоретичне розділення.
Таблиця 2. Склад буферних розчинів для проведення горизонтального електрофорезу.

Буферна система

Концентрації речовин в робочому буферному розчині

Приготування 1л концентрованого розчину відповідної кратності

трис-ацетат (ТАЕ)

0,04 М трис-ацетат;

0,002 М ЕДТА; рН 7,5-7,8

(50×): 242 г трис;

57,1 мл льодяної оцтової кислоти;

100 мл 0,5 М розчину ЕДТА, рН 8,0.

трис-фосфат (ТФЕ)

0,08 М трис-фосфат;

0,008 М ЕДТА; рН 7,5-7,8

(10×): 108 г трис;

15,5 мл 85%-вої фосфорної кислоти (1,679 мкг/мл);

40 мл 0,5 М розчину ЕДТА, рН 8,0.

трис-борат (ТБЕ)

0,089 М трис-борат;

0,089 М борна кислота;

0,002 М ЕДТА; рН 7,5-7,8

(5×): 54 г трис;

27,5 г борної кислоти;

20 мл 0,5 М розчину ЕДТА, рН 8,0.


Таблиця 3. Склад буферних розчинів для нанесення проб нуклеїнових кислот.

Тип буферного розчину


Концентрації речовин в 6-ти кратному концентрованому розчині

Температура зберігання

І

0,25% бромфенолового синього;

0,25% ксилолціанолу;

40% (вага/об’єм) сахарози;

готують з використанням дистильованої води

+4 ºС

ІІ

0,25% бромфенолового синього;

0,25% ксилолціанолу;

15% (об’єм/об’єм) фіколу (тип 400);

готують з використанням дистильованої води

Кімнатна

ІІІ

0,25% бромфенолового синього;

0,25% ксилолціанолу;

30% (об’єм/об’єм) гліцерину;

готують з використанням дистильованої води

+4 ºС

ІV

0,25% бромфенолового синього;

40% (вага/об’єм) сахарози;

готують з використанням дистильованої води

+4 ºС


Для нанесення проб ДНК в лунки агарозного геля також використовують певні буферні розчини різних типів (таблиця 3). Зазвичай буферні розчини для нанесення проб готують також у вигляді концентрованих 6-ти чи 10-ти кратних розчинів.

ЗАБАРВЛЕННЯ ДНК В АГАРОЗНИХ ГЕЛЯХ

Застереження: бромистий етидій-сильний мутаген! Усі маніпуляції з гелями і розчинами чи посудом, які містять цей барвник СЛІД ПРОВОДИТИ В СПЕЦІАЛЬНИХ ОДНОРАЗОВИХ РУКАВИЦЯХ!!!

Як зазначалось, найбільш зручним методом візуалізації ДНК в агарозних гелях є забарвлення флуоресціюючим інтеркалятором бромистим етидієм. Молекула цього барвника містить плоску циклічну групу, яка може інтеркалювати між сусідніми азотистими основами нуклеїнових кислот. В результаті інтеркаляції інтенсивність флюоресценції етидію бромистого підвищується. Енергія УФ-випромінювання, яка поглинається ДНК в області 260 нм передається на барвник, після чого барвник флюоресціює променями червоно-помаранчевої області видимого спектру. Слід зазначити, що барвник може флюоресціювати в цій зоні видимого спектру і при безпосередньому опроміненні його молекул в складі ДНК променями з довжиною хвилі 300-360 нм.


Бромистий етидій можна використовувати для виявлення як двох-, так і одноланцюгових молекул нуклеїнових кислот (ДНК та РНК). Щоправда, спорідненість барвника до одноланцюгових нуклеїнових кислот значно нижча, а, відповідно, флюоресценція слабша.

Бромистий етидій можна вносити і в електрофорезний буферний розчин (робоча концентрація 0,5 мкг/мл). Як зазначалось, у присутності цього барвника електрофоретична рухливість лінійних двохланцюгових молекул ДНК знижується приблизно на 15%.

Можна проводити електрофоретичне розділення і за відсутності бромистого етидію і здійснювати забарвлення після електрофорезу. У цьому випадку гель поміщають в електрофорезний буферний розчин або у дистильовану воду, які містять бромистий етидій (0,5 мкг/мл) на 45 хв при кімнатній температурі. При цьому не потрібно додаткового етапу знебарвлення фону, однак, при виявленні малих кількостей ДНК (менше 10 нг) рекомендується знизити фонову флюоресценцію (обумовлену незв’язаним барвником) витримуючи гель в 1 мМ розчині MgSO4 протягом 1 години при кімнатній температурі.
ПРИГОТУВАННЯ АГАРОЗНИХ ГЕЛІВ І ПРОВЕДЕННЯ ЕЛЕКТРОФОРЕЗУ

Увага: перед проведенням лабораторної роботи перечитайте підрозділи ,,Техніка безпеки” та ,,Забарвлення ДНК в агарозних гелях” та ознайомтесь з ОБОВ’ЯЗКОВИМИ запобіжними засобами при роботі з етидієм бромистим та трансілюмінатором!!!

1. Додайте розраховану кількість порошку агарози у відміряний об’єм відповідного буферного розчину (ТАЕ, ТБЕ або ТФЕ) для електрофорезу.

2. Нагрійте суспензію агарози на киплячій водяній бані до повного розчинення.

3. Охолодіть розчин агарози до 50 ºС і додайте бромистий етидій (з водного розчину, який містить 10 мг/мл; розчин зберігають при +4 ºС в непроникному для світла посуді). Кінцева концентрація бромистого етидію в розчині агарози повинна становити 0,5 мкг/мл.

4. Підготуйте форму для заливки агарозного геля: встановіть форму на горизонтальній поверхні на листку паперу; відповідним чином закріпіть над формою гребінку для формування лунок для проб - щоб між зубцями гребінки і дном форми залишалось 1-1,5 мм.


5. Вилийте розчин агарози в підготовану форму для формування геля.

6. Після того, як гель остаточно затвердіє (20-45 хв - за кімнатної температури), обережно видаліть гребінку і помістіть гель на платформі приладу для електрофорезу.

7. Додайте необхідну кількість буферного розчину для проведення електрофорезу (ТАЕ, ТБЕ, ТФЕ; буферний розчин повинен бути однакового складу з відповідним розчином для приготування агарозного геля). Шар буферного розчину повинен покривати агарозний гель щонайменше на 1 мм.

8. Змішайте проби ДНК з відповідним об’ємом 6-ти кратного буферного розчину для нанесення проб. Внесіть приготовані проби в лунки геля під електрофорезним буферним розчином.

9. Закрийте прилад для електрофорезу кришкою і підключіть до джерела струму. Встановіть відповідні показники сили струму та напруги (не більше 5 В/см довжини гелю!!!).

10. Після електрофоретичного розділення нуклеїнових кислот перенесіть гель на трансілюмінатор і сфотографуйте. Кількісну обробку отриманих результатів здійсніть за допомогою комп’ютерної програми TotalLab v2.01.

Максимальна кількість проби нуклеїнових кислот, яку можна внести в лунку залежить від числа фрагментів ДНК чи РНК в пробі та від їх молекулярної маси. Мінімальна кількість ДНК, яку можна виявити при фотографуванні геля бромистим етидієм становить близько 2 нг, при ширині полоси 0,5 см. Якщо лунка буде переповнена і в полосі зазначеної ширини буде міститись більше 200 нг ДНК, то полоса буде розмитою з характерним шлейфом. Цей недолік особливо виражений при розділенні великих фрагментів ДНК.

При аналізі простого набору молекул ДНК в лунку довжиною 0,5 см вносять 0,2-0,5 мкг сумарної ДНК. Якщо проби містять дуже велику кількість фрагментів ДНК різних розмірів (наприклад, суміш продуктів рестрикційного аналізу геномної ДНК еукаріот), то в лунку можна внести 5-10 мкг сумарної ДНК.

Контрольні запитання.

1. Назвіть і охарактеризуйте 5 головних параметрів які впливають на швидкість та ефективність електрофоретичного розділення нуклеїнових кислот в агарозному гелі.


2. Охарактеризуйте принципи візуалізації нуклеїнових кислот в агарозних гелях після електрофоретичного розділення.

3. Протягом попередніх двох лабораторних робіт Ви провели ПЛР-ампліфікацію за допомогою відповідних тест-наборів та рестрикцію ДНК бактеріофага λ. Охарактеризуйте продукти ПЛР та рестрикції візуалізовані після розділення в агарозі.

4. Проаналізуйте склад буферних розчинів для нанесення проб нуклеїнових кислот (таблиця 3), поясніть призначення окремих складових.

5. Проаналізуйте склад буферних розчинів для проведення горизонтального електрофорезу (таблиця 2), поясніть призначення окремих складових.

Література

1. Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование.//Москва ,,Мир”. - 1984. - ст. 157-167.

2. Інтернет-ресурс www.molbiol.ru.

3. Каталог фірми ,,Fermentas” (life sciences; molecular biology) за 2010-2011 рр.